FORMULAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DI NUOVI TIPI DI NANOPARTICELLE PER STRATEGIE DI “DRUG DELIVERY” A LIVELLO CEREBRALE

Attualmente le malattie neurodegenerative e cerebrovascolari hanno un impatto crescente sia dal punto di vista sociale che economico. Pertanto lo sviluppo di nuove strategie per una diagnosi precoce e per un trattamento efficace e sicuro di tali patologie sta diventando sempre più importante. Per queste ragioni, la ricerca di sistemi in grado di passare la barriera emato-encefalica per il trasporto di molecole terapeutiche a livello di sistema nervoso centrale (SNC) rappresenta una delle sfide più impegnative. La selettività della barriera emato-encefalica limita fortemente il numero di sostanze terapeutiche in grado di raggiungere il cervello e pertanto, negli ultimi anni, molti sforzi vengono rivolti allo sviluppo di sistemi che facilitino il passaggio dei farmaci verso il SNC. Tra questi, l’approccio basato sulle nanotecnologie sembra essere molto promettente. Tale approccio comporta l'uso di almeno due componenti, uno dei quali è costituito da una nanoparticella, che funge da vettore (nano-carrier), e l'altro è l'agente terapeutico (cargo). La ricerca in atto ha lo scopo di indagare la potenziale efficacia di nanoparticelle solido-lipidiche coniugate con il farmaco Rapamicina (Rp-SLN) per la cura delle malattie neurodegenerative. Recentemente è stato dimostrato che l’inibizione specifica di mTOR, un complesso molecolare che riveste un ruolo centrale nel controllo della omeostasi cellulare, da parte della Rapamicina (Rp) è in grado di migliorare il comportamento cognitivo nel modello murino della Malattia di Alzheimer. mTOR è una serina / treonina chinasi implicata nella regolazione del metabolismo energetico, della proliferazione e motilità cellulare e dell'autofagia. mTOR forma due diversi complessi enzimatici, 46 mTORC1 e mTORC2. mTORC1 integra stimoli diversi provenienti da nutrienti, fattori di crescita, stato energetico e stress, interagendo strettamente con il complesso TSC1-TSC2 [Maiese et al., 2013 Trends Mol Med. 195, 1-60]. La Rp è un farmaco immunomodulatore approvato dalla US Food and Drug Administration per l'uso clinico come immunosoppressore. Attualmente viene usato per indurre tolleranza in pazienti che hanno subito trapianto d’ organo, ma anche in oncologia per il trattamento del carcinoma renale avanzato. Studi recenti dimostrano che il trattamento con Rp, o con il suo analogo Everolimus, apporta benefici neurologici nella Sclerosi Tuberosa (TS) [Krueger et al. 2010 N Engl J Med 363,1801-11], una malattia genetica associata allo sviluppo di tumori al cervello e nella Malattia di Alzheimer [Caccamo et al. J Biol Chem 2010, 285, 13.107-20]. La Rp ed il suo analogo sono in grado di passare la barriera emato-encefalica ed apportare significativi benefici nelle due patologie neurodegenerative sopra citate, ma la loro somministrazione sistemica produce una serie di effetti indesiderati che possono compromettere la loro efficacia terapeutica, soprattutto se si pensa ad una loro somministrazione cronica. D’altro canto una somministrazione in loco sarebbe troppo invasiva e non consona ad un trattamento prolungato e precoce, quando ancora la sintomatologia non è conclamata. Al fine di mettere a punto una strategia terapeutica a bassa invasività basata su un sistema di nano-carrier specifico in grado di superare la barriera emato-encefalica e rilasciare in modo efficace una dose terapeutica del farmaco, abbiamo sintetizzato nanoparticelle solido-lipidiche caricate con Rp e opportunamente funzionalizzate con polisorbato 80 (P80). Il P80 ha il duplice ruolo di stabilizzatore e modificatore di superficie, in grado di favorire l'adsorbimento delle apolipoproteine sulla superficie delle particelle, convogliando così le stesse nel pathway dei recettori delle LDL presenti sulla barriera emato-encefalica e consentendone così l’attraversamento ed il rilascio del loro contenuto (che in questo caso era rappresentato da un colorante) a livello di sistema nervoso centrale [Blasi 2007Advanced Drug Delivery Recensioni 59, 454-477]. Le Rp-SLN sono state da noi preparate con il metodo della omogeneizzazione a freddo ad alta pressione. Il Cetil-palmitato e la Rp (10 e 20% p/p) sono stati sciolti in cloroformio e adeguatamente miscelati con una soluzione acquosa di P80 all’1% (p/v) per ottenere una microemulsione olio-acqua. La produzione delle Rp-SLN consiste in 5 cicli di omogeneizzazione ad alta pressione. Il cloroformio è stato allontanato o over-night a temperatura ambiente oppure mediante evaporazione rapida sotto vuoto. Misure di light-scattering dinamico hanno evidenziato che la dimensione media delle particelle è tra 50 e 200 nm. Il potenziale zeta è risultato essere neutro per le preparazioni ottenute mediante evaporazione rapida, mentre con tempi di evaporazione lunghi le Rp-SLN risultano cariche negativamente. La differenza osservata è correlata alla quantità di farmaco presente sulla superficie delle particelle che aumenta con il tempo di caricamento. L’intrappolamento del farmaco è stato valutato mediante spettroscopia UV. Misure della Rp nel 47 sopranatante opportunamente centrifugato e filtrato hanno evidenziato una efficienza di incapsulamento compresa tra 84 e 90%. Inoltre è stata effettuata una analisi TEM per controllare la morfologia delle particelle ed escludere la presenza di nanocristalli di Rp. La eventuale citotossicità delle Rp-SLN ed il grado di internalizzazione sono stati analizzati in vitro in cellule SH-SY5Y (modello cellulare neurale) ed in cellule staminali neuronali. In queste ultime, da noi prodotte a partire dal modello murino di Alzheimer o da quello di Sclerosi Tuberosa, è stato valutato il livello di inibizione di mTOR dopo esposizione alle Rp-SLN e quindi l’effetto terapeutico. Sulla base dei dati ottenuti abbiamo ora intrapreso la preparazione di Rp-SLN marcate con una sonda fluorescente per valutare in vivo la loro capacità di oltrepassare la barriera-ematoencefalica e di trasportare le dosi terapeutiche di Rp a livello di sistema nervoso centrale.